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| 氣相色譜分析確證轉基因植株具有合成PHB能力 | |||
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自然界中多種細菌的碳源及能源貯藏物這種聚酯的物理化學特性與激進塑料相似，聚三羥基丁酸酯（PHB;種子特異性啟動子;葉綠體基因工程;煙草;油菜及其它類型的聚3-羥基鏈烷酸酯同屬于聚酯類物質。并具有生物可降解性，如能取代化學合成塑料將減少環境中的塑料廢棄物，從源頭治理“紅色污染”問題。微生物發酵法生產的PHB價格過高，無法在市場上與化學合成塑料競爭。隨著分子生物學的發展，人們逐漸將視線轉向植物生物反應器。轉基因植物能夠利用二氧化碳為碳源、太陽能為能源合成目的產物，大大降低生產本錢，為生產具有市場競爭力的新型生物可降解塑料提供可行途徑。此領域雖然已取得一定進展，但遠未達到商業化生產水平。大規模商業化生產要求轉基因植物能夠在確保環境平安性的前提下高效、穩定地生產PHB本文嘗試改善植物中PHB生產體系，為環保型塑料早日進入市場作出努力。由于表達框架中多次使用同一啟動子會導致基因緘默，本文克隆了另一種子特異性啟動子nap300以替換重復使用的7S啟動子，減輕“共抑制”將nap300與GUS基因相連進行功能鑒定。
熒光檢測和組織化學染色的結果都證明此僅300bpDNA 序列足以調控基因進行種子特異性表達。盡管B盒作為高度激進區在種子特異性表達中起重要作用，位于此處的兩個堿基替代型突變并未使nap300活性明顯降低，對啟動子的時空表達模式也無明顯影響。將nap3007S分別與phbA 基因(編碼 3-酮硫裂解酶)相連，相似表達環境中對二者功能進行比擬，發現兩個啟動子表達模式基本相同并在同一時期達到活性高峰，因此nap300可用于改善PHB合成基因在植物體內的表達調控。通過對種子特異性啟動子的比較可加深對其表達模式的解，為植物基因工程中的精細調控提供依據。葉綠體基因工程是隨著植物遺傳轉化技術發展剛剛興起的生物技術，具有超量表達外源基因，為原核基因提供適宜表達環境，消除“位置效應”和基因沉默，環境平安性好等優點，較更適合用于植物生物反應器方面的研究。本研究在國內率先探討將葉綠體轉化技術引入植物生產生物可降解塑料這一領域的可行性(國外僅有日本一例)構建了葉綠體轉化及表達載體pPV-PHB通過基因槍法將PHB合成相關基因導入煙草葉綠體基因組。轉基因煙草順利達到同質化，其形態和生長發育均無異常。Northern點雜交檢測標明與PHB合成相關的三個基因均能在轉錄水平表達，未出現核轉化中經常發生的基因緘默”現象。通過RT-PCR進一步檢測標明葉綠體型轉基因煙草中目的基因的表達水平明顯比核轉化植株中相應基因的表達水平高。氣相色譜分析確證轉基因植株具有合成PHB能力。
這些都標明葉綠體轉化適合用于轉基因植物生產PHB中 文 摘 要的研究。雖然葉綠體型轉基因煙草中產物含量偏低，并未達到預期結果，但經進一步改進與完善，終將會勝利地用于生產高附加值產品的植物基因工程中。為初步探討葉綠體轉化中在同源重組反應介導下整合外源基因的機理，從油菜葉綠體基因組中分離兩段序列作為同源片段，基因槍法轉化煙草，結果顯示即使供體所含同源片段與受體葉綠體基因組相應區域差異高達 10％，轉化效率也無降低。這一現象的發現有助于促進“通用載體”改進，擴展葉綠體轉化受體范圍乃至達到商業化應用水平。勝利地通過H次轉化獲得整合并表達多基因的轉基因煙草，縮短了研究周期，對相關轉基因植物的研究有一定參考價值。本文還優化了油菜轉化體系，使轉基因油菜同時整合三個 PHB合成相關基因的效率由 7．69O增加至 16．00田間試驗與產物分析正在進行中。
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