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| 化學(xué)農(nóng)藥的過量施用使病原菌的抗藥性增強(qiáng) | |||
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| 導(dǎo)致抗性作物品種經(jīng)常喪失抗性，另外化學(xué)農(nóng)藥的過量施用使病原菌的抗藥性增強(qiáng)，造成防治難度加大。有機(jī)農(nóng)藥使用后的殘留，造成對生物以及環(huán)境的破壞，一定水平上也造成對人體的危害。因此，隨著人們環(huán)保意識的增強(qiáng)，生物防治特別是生物農(nóng)藥的使用已成為防治植物病害的趨勢，市場對開發(fā)新型的生物農(nóng)藥也有著迫切的需求。植物在同病原物競爭進(jìn)化過程中，已形成一系列防御機(jī)制，過敏反應(yīng)(HR和系統(tǒng)獲得抗性(SA R就是這種防御機(jī)制的典型表示。某些小分子物質(zhì)能夠誘導(dǎo)植物發(fā)生這種防衛(wèi)反應(yīng)。這種防衛(wèi)反應(yīng)的發(fā)生，可以抵抗多種多樣的病原物對植物的第二次侵染，類似于人或動物的免疫系統(tǒng)，利用植物的這種誘導(dǎo)抗病性和生物防治菌的特性來開發(fā)新型的生物農(nóng)藥應(yīng)該十分可行。綠色木霉(Trichodermavirid一種腐生性生物防治微生物，其對植物病原真菌的拮抗作用包括競爭作用、重寄生作用及抗生作用等方面。如果用木霉來表達(dá)誘導(dǎo)植物抗病性蛋白，并利用木霉的腐生特點(diǎn)來傳達(dá)該蛋白，這將大大增加木霉的應(yīng)用范圍，也為開發(fā)可持續(xù)利用的生物農(nóng)藥提供一條可行的途徑。為了驗證這種想法，使用了隱地疫霉(Phytophthoracryptogea分泌的隱地蛋白(Cryptogein,植物病害一直是制約農(nóng)作物豐產(chǎn)的主要因素之一。許多重大病害病原菌的頻繁變易。Crypt作為誘導(dǎo)植物SA R激發(fā)子。通過基因轉(zhuǎn)化的方法獲得了含有隱地蛋白基因以及其第13位點(diǎn)突變基因的綠色木霉工程菌，綠色木霉在作為隱地蛋白的傳達(dá)載體的同時，出現(xiàn)了誘導(dǎo)煙草抗病的功能。實(shí)驗研究的主要內(nèi)容包括以下幾個部分：1．構(gòu)建了綠色木霉轉(zhuǎn)化的pCSNTCC和pCSNTCCm載體。為了能使綠色木霉合成的外源激發(fā)子蛋白分泌到培養(yǎng)液中，Crypt和其突變CrypK13VPCR定點(diǎn)突變，第13位氨基酸由賴氨酸‘K突變?yōu)槔i氨酸‘V基因前插入信號肽序列，引導(dǎo)外源激發(fā)子蛋白分泌到木霉細(xì)胞外，與寄主植物直接作用，誘導(dǎo)植物的防衛(wèi)反應(yīng)。合成信號肽基因ThChi和目的基因Crypt和CrypK13V基礎(chǔ)上，以真菌表達(dá)載體pCSN43以及PBS載體為基本框架，經(jīng)過系列酶切、連接以及轉(zhuǎn)化等分子生物學(xué)技術(shù)，構(gòu)建了crmt基因轉(zhuǎn)化綠色木霉的真菌表達(dá)載體PCSNTCC和0丁貝W3廠基因轉(zhuǎn)化綠色木霉真菌表達(dá)載體PCSNTCCm2．建立了綠色木霉的轉(zhuǎn)化體系。對綠色木霉原生質(zhì)體制備和再生條件進(jìn)行了較詳細(xì)的分析，并在此基礎(chǔ)上，利用限制酶介導(dǎo)進(jìn)行了木霉原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化。結(jié)果標(biāo)明，木霉原生質(zhì)體形成的合適條件為：培養(yǎng)24h菌絲用4mg加LGlucanex磷酸鹽緩沖液中（pH6．9830C振蕩（40rmin酶解 4h原生質(zhì)體產(chǎn)量達(dá)到4．7X10個加g原生質(zhì)體在含 0．3molL肌醇和 0．3molLKCICM培養(yǎng)基上再生率為 14．5％。限制酶 ho介導(dǎo)轉(zhuǎn)化綠色木霉原生質(zhì)體，其轉(zhuǎn)化率為每微克DNA 得到12個轉(zhuǎn)化子。轉(zhuǎn)化子的PCR鑒定以及特異酶聯(lián)免疫測定（ELISA we上ern雜交檢測標(biāo)明，外源基因己轉(zhuǎn)入綠色木霉菌并在培養(yǎng)液中有穩(wěn)定的產(chǎn)物表達(dá)。30株原生質(zhì)體再生株被確定為穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化子，其中＊－1至＊－20為CryPt基因轉(zhuǎn)化子，TVZI至＊－30為o地們3V基因轉(zhuǎn)化子。3．轉(zhuǎn)化子誘導(dǎo)植物抗病性 轉(zhuǎn)化子的抗病分析結(jié)果標(biāo)明，轉(zhuǎn)基因木霉菌株TV七和 TV六4等能夠分泌CryPt或CryK13V木霉動身株及轉(zhuǎn)基因木霉抱子處理煙草2個品種和十字花科植物擬南芥uthalfana根部 10d后，離體接種和植株整株接種病原菌，實(shí)驗標(biāo)明轉(zhuǎn)化子能夠提高煙草對黑腔病菌（PhytOPhthomPrasftfcavarnlcotianad赤星病菌（Altemarfaaltata和煙草花葉病毒（TMV抗性，分子雜交檢測標(biāo)明，轉(zhuǎn)化于能夠誘導(dǎo)煙草PR基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)化于處置擬南芥，接種丁香假單胞菌和立枯絲核菌，離體接種和分子水平雜交均表明，擬南芥抗病性基本沒有得到提高，標(biāo)明Crypt誘導(dǎo)抗病性具有一定的?；浴?．篩選轉(zhuǎn)化子TV3發(fā)酵培養(yǎng)基 轉(zhuǎn)化于TV3培養(yǎng)基篩選實(shí)驗標(biāo)明，合適的利于工業(yè)化的固體生產(chǎn)RPA 培養(yǎng)基，組成配比為：40％稻草，5％豆餅粉，15％鼓皮，1．5％蔗糖，產(chǎn)抱量達(dá)到3．36X10cfumL液體MYG培養(yǎng)基，組成配比為麥芽汁30％，酵母提取物0．l％，葡萄糖1．5％，MgSO7Hzo0．l％，KHzPO0．1％，菌絲生物量達(dá)到6．74mgmL |
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