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| 評估芯片熒光成像系統的性能特點 | |||
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選擇單個組件，雖然是重要的，重要的是要認識到，儀器的性能取決于如何，所有的元素都整合成一個完整的工作系統。的電子電路，對應的光學元件，和移動部件的行為的所有影響的數據的質量。通過比較和量化的掃描圖像，而不是簡單地檢討各個組件的規格，性能表征應該總是做。
掃描儀校準。微陣列掃描儀等分析儀器必須執行一致，可以比較不同的結果，隨著時間的推移。此外，多個相同類型的工具必須科學的結果可以驗證，可以進行比較，以便產生數據。重復性特別是關鍵芯片成像儀由于上游化學和生物處理步驟產生顯著的變化。事實上，實驗可重復性仍然FDA批準用于診斷測試芯片的一個主要障礙。實驗誤差的來源和真實的變異生物更容易被隔離在一臺掃描儀，有助于最小的額外變化。然而，機械，光學，電子元件的使用壽命是有限的，所以性能會改變，因為儀器老化。一個強大的校準程序，可確保隨著時間的推移和多個掃描器之間的可重復性。
掃描儀校準需要一個已知的標準相匹配的儀器性能。這樣的標準可能包括的熒光材料的吸收和發射光相對應的儀器可供選擇的激發和發射頻段。樣品必須是光穩定的，這樣它給出了相同的重復長時間的使用后的信號輸出。例如，GenePix的掃描儀在出廠基準產生一個穩定的標準，使用定義的掃描設置指定的信號輸出。儀器附帶的測試標準，使用戶可以按照定期校準程序隨著時間的推移，重新調整到基準水平的儀器。多臺儀器可以進行調節，以同樣的方式，使得它們都產生基準信號電平，因此，在同一樣品產生相同的信號輸出。
檢測限。關于熒光成像最常見的誤解之一是，會有一個更光明的形象是一個更好的形象。不同類型和品牌的探測器，電子信號處理中的變化，模擬-數字轉換器的分辨率，以及其他設計上的差異，會產生不同的絕對強度值對于一個給定的功能。此外，顏色映射，對比度設置，甚至顯示器設置可以影響的表觀亮度不同的圖像。
檢測限指定小信號系統可以精確量化，不只是最低的信號，這可能是顯示器上可見。檢測限是最可靠的測量信號噪聲比（SNR）。6信噪比量化多么出色的系統可以解決信號從背景噪聲中的利益。對于成像應用，信噪比計算公式為：
作為一個比喻，可以考慮尋找一個2米的高大的稻草人（信號）在麥田（背景）。如果所有的玉米稈1米高，則是平均背景低于的信號，和標準偏差（噪聲）也低，所以稻草人將是清晰可見的。如果所有的玉米稈2米高時，則是平均背景相同的信號，雖然噪聲仍然很低，稻草人將不可??見。最后，如??果高的玉米稈范圍為0.5?3米多高，平均分配的平均背景為1.75米。背景是低于信號，但高度（即噪聲）的變化將使其很難看到稻草人。
因此，對于成像應用中，平均本底水平和背景的標準偏差必須被包含在計算中。在許多信號檢測學科作為樣本值SNR = 3.6，7下面這一點，功能可能是肉眼可見的最小信號，可以準確量化的一個標準已建立，但準確量化能力顯著減弱。
這是極其困難的一個絕對的標準量化的檢出限為熒光染料，僅僅是因為許多染料敏感的環境條件，特別是光與年齡。為了使這樣一個標準，用戶必須量化熒光光譜儀上的樣品中的染料被發現確切的摩爾量，附著到滑動時的特定的協議都在使用的溶液的體積，也知道?？梢詻]有postspotting的洗滌或其他治療，可能危及初步定量。即使有這樣的精心準備，絲毫衰減信號可能會導致樣品褪色低于檢測極限。
然而，在實踐中，與檢出限的值附近的任何芯片可以被用于簡單的掃描儀比較。要進行這樣的測試，兩個或兩個以上的相同的樣品應掃描在兩個單獨的工具，然后交換，并再次掃描正常化從在第一次掃描中的任何有害的影響（例如，光漂白）。SNR與低信號電平的一些相同的特征的比較，可以用來評估檢出限的差異，即使絕對的染料濃度是不提供這些功能的。
場均勻性均勻成像領域，確保數據可以準確地比較來自不同領域的微陣列玻片上。一個主要的因素，決定場的均勻性是幻燈片本身。最標準的顯微鏡載物片被指定為約40μm的整個表面上的平整度，表示滑動可能具有高低至40微米的小山和山谷。這些表面的變化轉化為定量的變化，特別是在景深的共聚焦系統，在該系統中，可能只有32-63微米。在這種系統中，樣品表面會進來的重點，因為它掃描。à系統具有較大的景深非共可容納滑動面的變化，以確保準確的集光，在整個掃描區域。微陣列的光學平面幻燈片市售。這些幻燈片的額外投資可能還清生產更多的可重復性的結果和更少的反復實驗。
儀器的子系統，如支持的滑動表面，在成像過程中，控制樣品的運動和/或激發源的組件，以及照明和收集光學場的均勻性都可以影響。在激光和白光的系統中，所有這些組件都必須精確地指定和對齊，以確保均勻的照明，在樣品表面上的所有點處。
場均勻性的理想的標準來評價。將一個光學平面的滑動，被均勻地涂覆有一個穩定的熒光材料的薄膜。然而，為了描述正確的均勻分布的一種儀器，測試標準本身有更均勻的問題，以便不貢獻其自己的非均勻性的測量儀器。盡管薄膜涂層技術是不是新的，所需要的均勻，穩定，熒光信號在顯微鏡幻燈片格式的標準尚未確定。
可以做一個合適的替代試驗與任何熒光芯片。只需掃描陣列在一個方向，旋轉180度，再次掃描，并比較相同點的信號強度在每個掃描。在第二次掃描的一貫較低的信號表明漂白。在任一方向的第三個掃描可以用來量化的漂白和減去其貢獻的均勻分析。這種旋轉測試場的均勻性是最可靠的措施，利用現有的工具。然而，它是有限的，是不對稱的，相對于旋轉的變化。例如，統一的山坡或山谷中間的幻燈片可能被發現。
圖4。重復性測試GenePix的4000B。一個穩定的重復掃描熒光塑料材質，每天四次六天（紅色通道，綠色通道500 V 700 V）。從幻燈片上的一個固定區域的信號的強度，計算相對熒光單位（RFU）。所有掃描之間的差異為1.6％，綠色通道和紅色通道的2.1％。誤差棒涵蓋從四個測量值的平均值的兩個標準devations（點擊放大）。
從一個單一的芯片實驗重現性。不能得出有意義的生物結論。用戶是否有資源創造無限的自己設計的陣列，或購買預制陣列的，可重復的結果的數量減少昂貴的實驗重復須制定統計學和生物學意義的結論。要確保可重復的結果，用戶必須首先遵守推薦的預熱時間和他們的儀器操作條件。特別是，激光器和白色光源需要的時間來穩定。此外，電子部件和運動部件可以容易受到極端溫度和濕度的影響。
微陣列成像系統的輸出信號的再現性，通過掃描一個穩定的熒光標準隨著時間的推移在相同的掃描儀設置（參見圖4），不可避免的長期信號漂移的最佳保險施加如上述的校準程序，可以進行測試。短期掃描到掃描的重現性，也可以測試與任何合理穩定的熒光樣品，但由于光漂白的任何信號劣化，必須測量中減去。
結論
各個組件的規格使制造商能夠定義他們所尋求的性能水平。然而，任何樂器的表現不取決于這些規格，但其整合成一個完整的系統功能。在微陣列的成像系統中，組件的質量，??設計的光學和電子學，和對應的所有元素確定最終圖像的質量，定量精度和重現性。仔細定量從相同的樣品的圖像準確地比較不同的成像系統是唯一的方法。芯片界目前缺乏強大的定量測試標準評估關鍵的性能參數，必須湊合著用有限的替代品。行業領導者正在與美國國家標準與技術研究所（NIST）合作設計和開發熒光芯片測試標準。這些NIST可追蹤工具將使制造商能夠達到新的水平卓越的芯片掃描儀設計。
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