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| 研究了靈芝細胞靜態培養過程關鍵因子 | |||
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靈芝是我國傳統的名貴藥用真菌,現代醫學研究表明靈芝酸具有抗癌和抗艾滋病、靈芝多糖具有免疫抗癌等生物活性.本論文采用靈芝菌絲體發酵來生產靈芝酸和靈芝多糖,著重開展了有關發酵工程的研究.提出了補料發酵同時生產靈芝多糖和靈芝酸的生物過程.首先,實驗表明乳糖有利于靈芝細胞生長、胞內多糖和靈芝酸生產；再通過采用一種簡單有效的補料策略,即殘糖濃度在5-10g／L時補糖,不但可以避免相對較高的乳糖起始濃度(>35g／L)對單位細胞靈芝酸合成的抑制作用,而且可以顯著提高靈芝酸的總產量和生產率,同時細胞量、靈芝多糖產量和生產率也獲得顯著提高.在本研究之前,還未見靈芝細胞高密度培養(>20g／L)的文獻報道.
就乳糖對細胞生理代謝的影響進行了較深入的研究.靈芝細胞中β-半乳糖苷酶酶活的存在表明在靈芝細胞中乳糖透性酶系統的存在,且觀察到乳糖對β-半乳糖苷酶合成的誘導作用.無論在搖瓶或生物反應器中,乳糖補加均能提高α-磷酸葡萄糖變位酶酶活與靈芝胞外多糖產量,這表明通過添加乳糖我們可以促使代謝流更多地向胞外多糖合成途徑遷移.
在靈芝深層發酵過程實驗室放大中,研究表明氧供應是一個關鍵因子.起始體積氧傳遞系數(K=a)和溶氧濃度(DO)顯著影響靈芝細胞生長、細胞形態和代謝物合成.靈芝酸的產量與生產率隨著起始K=a增大而增大；當起始K=a為96.0 h=時,靈芝酸的產量與生產率是K=a為16.4 h=時的1.8倍.當DO控制在10％的空氣飽和度時,細胞處于氧限制狀態；并且實驗結果表明氧限制有利于提高靈芝酸含量,但靈芝細胞生長受到限制.為獲得更多的細胞量、胞內多糖和靈芝酸的產量,該深層發酵過程中DO應控制在25％的空氣飽和度以上.
研究了靈芝細胞靜態培養過程從搖瓶到反應器規模的放大.研究表明靜態培養過程的關鍵放大因子是起始體積氧傳遞系數(K=a)、單位體積發酵液的表面積(A=)和轉入靜態培養前的菌球大小.當起始K=a為2.1 h=時,細胞形態發生了顯著變化,即發酵液表面形成一層白色菌絲體,同時靈芝酸含量與產量均獲得大幅度增加.這進一步證實氧限制有利于靈芝酸合成.在實驗范圍內,隨著A=的增加(0.24-1.53cm=／mL),表面形成的白色菌絲體量和靈芝酸的產量也隨之增多；而表面層和液體中兩者總的靈芝酸產量在A=為0.90 cm=／mL時達到最大.轉入靜態培養前的菌球顆粒越小越有利于靜態培養過程中表面層白色菌絲體的形成.基于較小的起始K=a和較大的A=有利于該靜態培養過程高效生產靈芝酸,我們設計了一種多層靜態培養反應器.最終,本研究成功地將靈芝細胞靜態培養過程從工作體積為20 mL的方瓶放大到總工作體積為7.5 L的多層（三層）靜態培養反應器.另外,構建了非結構動力學模型,并且它能很好地描述和模擬靜態培養過程中底物消耗、細胞生長和靈芝酸的生產.藥用真菌在分類上多歸于擔子菌亞門和子囊菌亞門，雖種類繁復，大小不相同，形狀萬千，但通常都是由菌絲體和子實體兩大有些組成。菌絲體是藥用真菌的養分器官，由許多菌絲調集而成，多呈絲狀或須狀，廣泛存在于土壤、樹木等各種基質中，相當于高等植物的根、莖、葉。菌絲具有不斷向外生長和擴大的才能，其主要效果是分化基質、吸收養分、運送和儲存養分并進行無性繁衍。當菌絲生長到必定時期，能彼此糾結構成菌索、菌核和子座等各種養分體的形狀。子實體是藥用真菌的繁衍器官，相當于高等植物的花、果，是藥用真菌發生孢子的安排。它和養分菌絲比較，功用發生了特異化。以傘菌為例，菌絲進一步構成菌絲束，菌絲束彼此扭結，逐漸發育成盤狀、顆粒狀，被稱為構成子實體的原基。原基進一步分化出菌蓋、菌褶、菌柄、菌環、菌托等。由于子實體的形狀萬千，為藥用真菌的分類供給了重要的根據。真菌的生殖方法可分為有性生殖和無性生殖兩大類。藥用真菌的有性生殖通常表現為兩個可親和的有性孢子萌生生成的兩種形狀無差別，但性別同的初生菌絲之間的聯系，其整個進程可分為質配、核配和減數分裂三個期間。無性生殖也有多種方法，有無性孢子的發生、菌絲體開裂以及芽殖等。藥用真菌的培育，菌索、菌核、子實體的安排別離，菌種轉管，均是使用無性生殖繁衍子孫的重要方式。
藥用真菌靈芝為主要研究對象，對靈芝的液體深層發酵工藝進行優化，運用原生質體技術進行了高產糖肽復合物新菌株的選育，以期提高深層發酵胞外PSPc的產量，研究了PSPc對肉仔雞的生產性能和對免疫功能的影響。 試驗一研究了靈芝液體深層發酵培養基中營養因子和非營養因子對PSPc分泌的影響，試驗證明較高的碳氮比有利于PSPc的分泌，而且纖維素、半纖維素、Mg、K、P等營養因子對于靈芝的發酵過程中PSPc的分泌都有著一定的影響，并且確定了比較適合的添加量為KH_2PO_41.5g／L，MgSO_4·7H_2O 0.75g／L，最佳的C／N為50：1，添加纖維素和半纖維素、核酸可以促進PSPc的產量。以此為根據確定了以豆粕、玉米和麥麩為主要成分的培養基，以利于深層發酵PSPc的生產。在初步的發酵試驗中PSPc的含量最高可以達到2.5mg／ml。 試驗二運用原生質體技術，進行高產PSPc新菌株的選育，(1)通過對靈芝和香菇原生質體的制備和再生的條件進行了探索，可以使原生質體的數量達到10~7／ml，為利用原生質體進行紫外線誘變和原生質體融合試驗打下了較好的基礎并提供了豐富的試驗材料。并利用熒光標記的方法，對靈芝和香菇的原生質體的融合條件和現象進行了觀察和研究。(2)利用紫外線誘變選育出了兩株在固體培養基上菌絲體生長速度和PSPc產量較高的新菌株(具體生產性能還有待進一步研究)。 試驗三研究了液體深層發酵生產的PSPc對肉仔雞的生產性能和免疫功能的影響。測定了不同生長階段肉仔雞的日增重、飼料轉化率、牛血清白蛋白抗體、淋巴細胞轉化率、死亡率、胸肌率、腿肌率和腹脂率。添加0.3％靈芝糖肽復合物飼料添加劑對肉仔雞前期(28天)的生長性能最好較對照組的日增重提高5％，存在極顯著差異(p＜0.01)，但是后期(47天)的生長性能與對照組差異不顯著。添加0.3％和0.5％靈芝糖肽復合物對于肉仔雞的免疫功能的增強效果是顯著差異的。
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