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| 液相-示差/蒸發光檢測器聯用法 | |||
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液相-示差/蒸發光檢測器聯用法PEG分子在280nm下并無特征紫外吸收，而活化后的PEG分子，由于活性基團的引入，可能存在214nm下的紫外吸收。因此，為了檢出以各種形式存在的PEG，應采用通用型檢測器，并結合凝膠或反相等高效液相色譜對修飾前后的rhGH及游離的PEG進行分離。由于示差檢測器的靈敏度較低，同時只能使用恒梯度流動相，因此，不適于檢出痕量的游離PEG。而蒸發光檢測器在上述方面有較大優勢。首先通過優化色譜條件，將PEG-rhGH、rhGH與游離PEG有效分離后，再將PEG從修飾后的rhGH上水解下來；通過計算水解后PEG減去游離PEG的量，再除以PEG的分子量得到偶聯到rhGH上的PEG的摩爾數，進而通過紫外檢測器求得rhGH的摩爾數，兩者之比再除以10（每分子rhGH的理論修飾位點），即可求得較為準確的平均修飾率。該方法不僅可適用于單位點或多位點PEG-rhGH的平均修飾率測定，而且可有效鑒別不同生產廠家使用的不同種類的PEG，同時可測定原液中的游離PEG含量，實現一個方法進行三項重要指標的質量控制。但是，目前該類方法可供參考的國內外文獻極少，方法的建立需要投入較大的工作量。
PEG的修飾位點rhGH上可發生PEG修飾的位點有10個，即使均為單位點修飾，理論上也可能存在10種位點異構體。同時，PEG分子本身是由一系列具有一定分子量分布的物質組成的混合物，因此，每一種位點異構體也就成為了較復雜的混合物。這就給PEG修飾位點的測定帶來了巨大的難度。目前可采用2種方法進行PEG修飾位點的測定：液相肽圖法與離子交換分離位點異構體法。這兩種方法都需要結合質譜，對rhGH液相肽圖中的色譜峰準確定性。在此基礎上，前者推斷修飾位點，后者可較為準確地測得修飾位點。
液相肽圖法首先需建立適宜的rhGH與PEG-rhGH的酶切方法。由于PEG是具有枝杈結構的大分子物質，與蛋白質分子共價結合后，由于其空間位阻的屏蔽作用，使得蛋白酶很難作用于PEG-rhGH，這也是PEG-rhGH在體內具有較長半衰期的原因。因此，對于PEG-rhGH，不能照搬rhGH藥典酶切方法，應深入研究個酶切參數，使得蛋白酶既能完全水解rhGH與PEG-rhGH，得到盡可能多的理論肽段，又能避免非特異性酶切片段的產生。
隨后應建立適宜的反相液相肽圖分離方法。一個經過優化的RP-HPLC液相肽圖，是控制PEG-rhGH修飾位點最直觀和便利的方法。因此，不可照搬rhGH藥典液相肽圖法，需反復優化色譜分離條件，使得通過比較修飾前后的肽圖，既可推斷PEG的修飾位點，又可將不同種類的PEG-rhGH與rhGH區分開。
二硫鍵未被還原的rhGH經胰蛋白酶酶切后，應產生19個理論肽段，除去3個極性很強無法保留的肽段T3、T5、T18以及1個僅含有1個lys的T17，應在RP-HPLC肽圖上出現至少15個肽段。同時通過還原酶切液，可推斷兩個二硫鍵肽段T20-SS-T21與T6-SS-T16的色譜峰位置。由于T20-SS-T21本身不含有PEG的修飾位點，T19肽段也不含有PEG修飾位點，因此在PEG修飾前后rhGH的酶切液中，該肽段不會發生峰位置和峰面積的變化。那么在酶切完全的前提下，rhGH酶切液中各個肽段的峰面積與T20-SS-T21或T20的峰面積之比（k值），應為一個相對固定的數值。而在PEG-rhGH的酶切液中，連有PEG的肽段，其保留時間將發生改變。雖然由于位點異構體的存在，該位點仍有未被PEG化的肽段出現，但是這一位置肽段的k值與未修飾rhGH的k值比較，應有所下降，且降低的程度反應了被修飾肽段的相對含量。因此，通過大量實驗，可累積獲得rhGH與PEG-rhGH各肽段的平均k值，根據兩者的k值變化，可以推斷哪些位點發生了主要的修飾及修飾肽段的大致含量。
由于有些PEG的位點異構體所占比例可能較低，難以通過k值變化進行測定，應盡可能對主要修飾肽段進行控制。方法成功建立后，除了可用于原液的鑒別檢查外，還可在質量標準中規定發生主要修飾的肽段，其峰面積百分比不得超過的限值。由該方法確立的主要修飾位點及所占比例，可通過兩種以上蛋白酶酶切及陽離子交換色譜與等電聚焦電泳進行深入的驗證分析。本文由對照品網整理提供如涉及文章版權問題請聯系作者刪除，文章轉載請注明地址：www.koudaiping.cn
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