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| 診斷測試和化驗使用微球基板或支持基于免疫 | |||
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微球可用于任何測試或試驗之前,他們必須準備綁定和涂有配位體(通常是蛋白質)。 微球的交互與其他測試組件,如過濾、膜,和磁鐵,也必須考慮到測試格式和微球的選擇。
涉及的分析物部分決定了格式。 分子分子量小于6000,例如,可能會很難發現一個三明治格式,因為許多這樣的小分子沒有空間兩個抗體。 小分子需要有競爭力的分析和測試。 大型分析物,如蛋白質,可以通過直接測量或抑制測試和化驗。
通過化驗,FDA將優先在工藝驗證。 制造商需要解決這個需求在開發過程的早期和選擇合適的方法。
測試組件
定制的microspheres-with特殊的化學性質, 1、2 比聚苯乙烯高或低密度,折射率高于或低于聚苯乙烯(亮或暗粒子比濁分析)——那些可用。 由于疏水作用是最可能的機制參與吸附的蛋白質,聚苯乙烯(疏水性聚合物)表面通常有高程度的非特異性蛋白吸附。 因此聚苯乙烯微球時可能不是最好的選擇,不會吸附 任何 蛋白質是必需的。 一個例子可能是抗體共價結合的微球,它所有的涂布蛋白一定共價至關重要。 微球表面由高水平的親水單體,丙烯酸和丙烯酰胺等nonadsorbing最為相象。
二氧化硅微球自然是親水的,所以沒有蛋白質吸附應該是非。 共價連接后,只有所需的抗原抗體反應應該發生。 二氧化硅和聚苯乙烯之間的密度差異(1.96克/毫升1.05二氧化硅和聚苯乙烯)沉降速度的一個關鍵區別。 因為在水中沉降取決于微球和水之間的密度差異(硅1.96 - 1.00 = 1.00;1.96 - 1.00 = 0.05聚苯乙烯),二氧化硅微球將解決大約19倍聚苯乙烯。 這種差異在沉降速度可以利用一些有趣的測試和分析基于微分建立時間的凝集和unagglutinated微球。
封裝的超順磁的粒子由聚合物/磁鐵礦核心密封在一個純聚合物殼或外層保護敏感酶接觸氧化鐵。
微球染色聚合過程中或之后在彩虹的顏色。 最初為改進的可見性和染色顏色的歧視,他們現在還與“fluorochromes”染色(單獨使用,或幾個相同的粒子),“fluorophors”(熒光染料與特定的光譜屬性),和scintillators(發出熒光染料暴露在射線或β射線)。 通常只需要少量的這些染料產生一個強烈的信號。
超順磁的微球可在不同的平均直徑、大小分布、表面化學性質和水平的磁鐵礦(可調響應磁鐵)。 更新的核/殼封裝,以防止鐵接觸敏感的酶或細胞。
將IgA、IgM或免疫球蛋白g被使用? 單克隆(Mc)或多克隆抗體(Pc)? 整個免疫球蛋白g或部分像F(ab) 2 、工廠或支持? 免疫球蛋白g(Fc的部分可以刪除,以避免類風濕因子(RF)的干擾,從而導致非特異性的綁定和自身凝集問題。) 當篩選PcAbs化驗,請求“濁度測定法和比濁法級”Abs,預選沉淀Abs一樣好。這種品質是一種預測他們可能會很好的吸附到聚苯乙烯,也許有利于凝集。
幾個因素權衡使用單克隆抗體而不是polyclonals。 單克隆抗體,這通常比polyclonals有較高的特異性,也通常綁定親和力較低。 Monoclonals也通常不會引起免疫沉淀反應。 這些特征差異多克隆和單克隆抗體與抗體吸附到微球的差異。
現在可以使用一些特殊蛋白質綁定,包括 轉導抗體 ——雙官能Ab旨在識別抗原和酶。 3 綁定一種酶抗原可能是一些不尋常的測試的基礎。 新的“miniantibodies”是二階陣線抗體片段,生長在 大腸桿菌 通過重組技術。 4 因為雞抗體不與射頻反應,補充干擾消除在測試中使用這些特殊的蛋白質。 5
重組聚合物免疫球蛋白g設計結合IgM的最佳性能和免疫球蛋白g補充反應。 6 低聚物,逐漸形成蛋白質的解決方案(如牛血清白蛋白和免疫球蛋白g)隨著時間的推移,吸附在微球比單體更快更牢固。 如果你 想要 寡聚物,等等,或者試圖加速老化的解決方案。 有可能創建合成寡聚物交聯蛋白或綁定合成聚合物。
與微球研究人員通常認為水是干凈的。 但即使商業去離子的水(DI)可以包含離子和有機物種吸附在微球;在這些情況下,微球干凈的水,而不是相反。
清潔
前粒子涂以蛋白質用于各種診斷測試和化驗,表面活性劑和其他溶質可能不得不被刪除。 最統一的聚苯乙烯微球是由乳液聚合使用表面活性劑(通常帶負電荷的烷基磺酸鹽、硫酸鹽,或羧化物)。 表面活性劑吸附在粒子表面;他們給粒子有一個負電荷,從而增加膠體的穩定性。 此外,surface-modified微球(COOH,北半球 2 和其他表面組織)可能含有水溶性聚合物(WSP),可以干擾蛋白質表面的耦合。 WSP,如果存在,取代蛋白偶聯反應設計蛋白微球。 Chloromethyl-modified粒子(用氯化vinylbenzyl單體)在高酸性的水溶液(pH < 3);前清洗去除酸耦合可能是可取的。
高度統一的聚合物微球。
雖然在研發過程的早期,它可能是一個好主意使用徹底清洗微球,通常沒有必要刪除所有在決賽中表面活性劑配方的產品。 這個決定取決于表面活性劑的類型和濃度,所需的蛋白質水平加載,測試或試驗設計的類型。 每個系統必須獨立評估。
統一的二氧化硅微球是由純Si(OC 2 H 5 ) 4 對水和氨。 因為純SiO合成微球 2 ,他們應該 沒有 表面活性的雜質,因此應在使用前不需要清理。
大多數polystyrene-based超順磁的微球是由與羧基acid-containing共聚合苯乙烯單體在膠狀磁鐵礦;他們可能包含一些WSP。 十二烷基硫酸鈉(SDS)添加到確保長期膠體的穩定性。
particle-cleaning方法選擇應該不僅能夠去除表面活性劑涂層后還剩余的蛋白質。 大多數方法去除表面活性劑或釋放的蛋白質。
洗滌。 重復離心法、減壓和resuspending水通常是第一個清潔方法。 必須轉到微球形成一個緊密的“按鈕”,允許清潔分離(傾析)的液體從固體。 顆粒越小,越困難的這種分離。 如果使用剎車停止離心機,粒子可能是部分resuspended減壓,他們中的一些人失去了。
卸載后,添加新鮮水或緩沖,應該完全resuspended微球。 有效清洗必須完全redisperse微球。 再懸浮應該進行一些可靠的方法,如顯微鏡檢查或快速檢測尺寸分析,驗證粒子主要是單一的,只有幾個對比。 表面活性劑被移除,微球堅持彼此更緊密;緩沖進一步增強這種效果。 更大的粒子(> 0.8?m)更容易旋轉,不太可能牢牢地粘在一起,更容易resuspended。 親水微球和protein-coated微球后粘在一起不太可能比noncoated離心法或疏水微球。
計算微球所產生的沉降速度和重力(G)部隊離心機可以確定執行必要的時間自旋向下一個特定大小的微球。 7 微球< 50海里(< 0.050?m)可能需要> 300000 G沉積物他們有效地(即。 10-cm / hr沉降速度)。
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