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| 阻斷策略在酶聯(lián)免疫測定中使用的尼龍膜 | |||
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在膜為基礎(chǔ)的酶聯(lián)免疫吸附系統(tǒng)，靈敏度，背景和信號強度的發(fā)展是首要關(guān)心的問題。這些參數(shù)包括：受開發(fā)者的選擇膜，阻斷策略，抗體濃度，酶和底物。所有這些因素是相互關(guān)聯(lián)的。來確定膜的化學(xué)和阻斷策略的影響，測定的開發(fā)常規(guī)轉(zhuǎn)向的原料和試劑的制造商。
尼龍膜通常用于ELISA的應(yīng)用，并且可與多種表面化學(xué)組成。由于在選擇表面化學(xué)，仔細(xì)注意阻斷策略需要達(dá)到最好的效果。斑點印跡實驗中，在其中多個變量被操縱以簡單的矩陣形式，可以快速引導(dǎo)開發(fā)者的表面狀況的最佳結(jié)合，阻斷濃度和試劑。本文介紹的模型分析系統(tǒng)和實驗，可用于優(yōu)化膜的選擇和阻塞。
背景
基于膜的酶聯(lián)免疫吸附測試通常配置為在其中一個膜壓靠在吸濕墊和溶液被輸送到膜的上表面流過的裝置。1的初級抗體結(jié)合到膜的表面，這是然后封鎖，以防止非特異性結(jié)合。被分析物是在一個測試溶液，它可以是一個緩沖或體液。第二抗體，綴合到一種酶，可以是直接添加到測試溶液或在分析物后的一個單獨步驟。以產(chǎn)生信號，洗滌膜并孵育色形成的基板。
許多ELISA試驗中使用的尼龍膜作為支撐基體。24除了它們的兩性（未修飾的）的形式，尼龍膜，可在形式與各種表面化學(xué)性質(zhì)，包括那些具有氨基和羧基基團(tuán)，季銨基，羧基和羥基的，而對于共價活性基團(tuán)結(jié)合。顯影劑的選擇膜的應(yīng)根據(jù)經(jīng)驗確定，根據(jù)它如何好與其他所有測試試劑相互作用。
要獲得良好的測試結(jié)果，關(guān)鍵是要阻斷可在膜的任何非特異性結(jié)合位點。58使用封閉劑的正確類型和數(shù)量是重要的;阻塞不足可能導(dǎo)致高背景，而過度封鎖可能會降低靈敏度。該封端劑通常用于硝化纖維素或聚苯乙烯微孔板，如牛血清白蛋白（BSA）和魚明膠，都不能有效地阻斷尼龍膜上。雖然干牛奶配方是用于與尼龍膜使用流行的選擇，最有效的阻擋制劑可用于所有類型的膜是Hammersten同類酪蛋白的溶液中，在0.05?0.5％在緩沖液中使用的，與表面活性劑的低濃度在一起。
初級和次級抗體濃度的平衡也可能會影響測定。的靈敏度和背景912，例如，增加，以達(dá)到更高的靈敏度的二次抗體的酶的濃度也可導(dǎo)致較高的背景。系統(tǒng)的性能也會受到影響由開發(fā)者選擇的酶底物，13與快速發(fā)展時期的基材可能會導(dǎo)致更高的背景水平比一個有發(fā)展緩慢的時間。
開發(fā)一種新的測定時，所有這些因素都必須考慮到，任何測定系統(tǒng)總是需要的靈敏度和背景（選擇性）之間的平衡。以優(yōu)化測定法的性能，可以將變量矩陣變換以簡單的斑點印跡實驗。只有少數(shù)實驗需要確定在此過程中的每個步驟盡可能好的條件。
方法
模型酶聯(lián)免疫吸附系統(tǒng)。一個模型的夾心ELISA系統(tǒng)，使用山羊抗兔IgG抗體作為第一抗體（R2004，Sigma化學(xué)公司，St.Louis），兔antigoat IgG作為抗原（G4018，Sigma）的設(shè)計，并且羊抗兔IgG的綴合至過氧化物酶（A0545， Sigma公司）作為第二抗體。底物溶液包括0.1毫克/毫升diaminobenzidene，1毫克/毫升咪唑和0.03％的H 2 ? 2（全部購自Sigma）。膜是由頗爾公司（東山，紐約州）提供。阻斷劑包括牛血清白蛋白，明膠（Sigma）和Hammersten同類酪蛋白（Gallard施萊辛格，韋斯特伯里，NY）。
使用移液器，初級抗體為1?100毫微克的稀釋液應(yīng)用到膜卡作為1微升的斑點。將膜在空氣中干燥5分鐘，并阻斷與下列之一：
5％BSA / PBS。
5％的明膠/ PBS中。
0.1％的Hammersten同類酪蛋白，0.05％吐溫20。
0.5％的Hammersten同類酪蛋白，0.05％吐溫20。
膜浸入封閉液在室溫下30分鐘。封閉后，將膜孵育100毫微克/毫升抗原的10分鐘。膜用封閉液短暫洗滌，然后與一個1/500稀釋的偶聯(lián)物10分鐘。膜洗滌3次，每次洗滌2分鐘，用0.??1％吐溫20/water然后孵育2分鐘的底物溶液。將膜在水中漂洗，并在空氣中干燥。
免疫檢測地高辛標(biāo)記的DNA探針。 的LAMBDA的HindⅢDNA（含1毫微克至1皮克/微升）稀釋物點到尼龍膜上。的點進(jìn)行空氣干燥15分鐘。為的Biodyne乙膜，DNA固定烘烤;對于所有其他的膜，DNA是通過暴露于紫外光固定（3分鐘，手持式光源，Mineralight R52G，6英寸）。在膜上的DNA通過使用地高辛標(biāo)記的探針，并antidigoxigenin抗體綴合至堿性磷酸酶，用BCIP / NBT底物（天才試劑盒，Boehringer Mannheim公司，阿靈頓，IL）進(jìn)行檢測。不同的封閉劑（無塊，BSA，寶靈曼阻斷劑，或Hammersten級酪蛋白）均在預(yù)雜交，雜交和阻斷步驟中添加。膜按試劑盒說明書進(jìn)行處理。
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